| | | |


Marie Štefková

Studium genů jetele (Trifolium spp.) podílejících se na biosyntéze fytoestrogenů

Ze sekvenačních dat Trifolium pratense byly identifikovány geny biosyntetické dráhy izoflavonoidů in silico a navrženy specifické primery pro jejich detekci amplifikací. Jejich funkčnost byla následně ověřena, čímž se také potvrdila správnost sekvenačních dat. Byla izolována RNA z rostlin rodu Trifolium a zjištěna přítomnost exprese daných genů v těchto vzorcích. Byly optimalizovány podmínky pro qRT-PCR a byl vybrán gen pro endogenní kotrolu exprese. Byla provedena kvantitativní analýza exprese vybraných genů a byly identifikovány kandidátní geny pro další analýzy.

1) Ze sekvenačních dat Trifolium pratense byly identifikovány geny kódující enzymy biosyntetické dráhy izoflavonoidů in silico. Jedná se o 9 enzymů, z nichž každý je reprezentován genovou rodinou. Navíc byly identifikovány geny pro enzym, který figuruje v konkurenční biosyntetické dráze. Funkce těchto genů z T. pratense pak byly ověřeny srovnáním se sekvencemi příslušných enzymů z databáze GenBank, a to na úrovni sekvence nukleotidů i aminokyselin. Pro expresní analýzu byly vybrány dva enzymy na základě jejich pozice v dané biosyntetické dráze. Jedná se o EC2.3.1.74, k němuž bylo u T. pratense identifikováno 38 genů, a EC2.3.1.170, k němuž bylo identifikováno 14 genů. Vybraný enzym konkurenční dráhy EC1.14.11.9 kóduje 9 genů.

2) Byly navrženy sekvenčně specifické primery pro expresní analýzu a jejich funkčnost byla ověřena pomocí PCR a elektroforézou na agarózovém gelu. Pro geny z rodiny EC2.3.1.74 to bylo 16 párů primerů, z nichž bylo funkčních 12. Pro geny z rodiny EC2.3.1.170 to bylo 6 párů primerů a pro geny z rodiny EC1.14.11.9 bylo navrženo 5 párů primerů a všechny byly funkční. Tímto byla také ověřena správnost sekvenačních dat. K ostatním genům nebylo možné navrhnout primery tak, aby byly specifické, což je způsobeno vysokou sekvenční homologií genů v rámci dané genové rodiny.

3) Byla izolována RNA z rostlin T. medium, T. pratense odrůda Tatra a odrůda Amos a také z dvou souborů rostlin T. pratense odrůda Pramedi. Tyto soubory byly sestaveny vzhledem k jejich kontrastnímu fenotypu tzn. s vysokým či nízkým obsahem daného fytoestrogenu. RNA byla zpětně přepsána do cDNA a byla provedena kvalitativní expresní analýza metodou PCR a elektroforézou na agarózovém gelu. V rámci zmíněných kontrastních skupin rostlin se většina testovaných genů exprimuje, na první pohled je však míra exprese nezávislá na zjištěném fenotypu tj. obsahu fytoestrogenů. Výraznější rozdíly v expresi byly pozorovány při porovnání T. medium a jednotlivých odrůd T. pratense mezi sebou, kvantitativní expresní analýza tedy byla směřována do této skupiny vzorků. Pro ověření, zda má na expresi vliv také úroveň ploidie rostliny, byla do této skupiny zařazena i T. pratense odrůda Start, která je diploidní na rozdíl od ostatních odrůd, které jsou tetraploidní, a T. medium, který je oktoploidní.

4) Byly optimalizovány podmínky pro metodu PCR v reálném čase. Pro kontrolu stabilní exprese byl vybrán gen pro ubikvitin-konjugující enzym E2 (UBC2), jehož expresní stabilita byla ověřena na vybraném souboru vzorků. Problémy s dostatečnou kvalitou vzorků byly vyřešeny úpravou postupu purifikace izolované RNA – účinější odstranění kontaminace genomickou DNA a odstranění PCR inhibitorů, které snižovaly účinnost amplifikace. Dalším problémem byly dimery primerů, které se při analýze některých genů tvořily ve větší míře a bránily tak amplifikaci nebo znemožňovaly správnou detekci fluorescence. Jejich částečnému odstranění napomohla úprava teplot cyklické fáze PCR, kdy k detekci fluorescence dochází při teplotě vyšší než je teplota tání dimerů a zároveň nižší než je teplota tání produktu analyzovaného genu.

5) Celkem bylo analyzováno 13 genů, z toho 9 z rodiny EC2.3.1.74 a 4 z rodiny EC2.3.1.170. U 3 genů byla anlýza neúspěšná z důvodu chybné amplifikace nebo nečitelných výsledků. Byly pozorovány velké rozdíly v expresi i v rámci jedné odrůdy, a to mezi vzorky z různých izolací. Tato technická variabilita byla částečně eliminována zahrnutím dvojic vzorků z různých izolací a zprůměrováním jejich míry exprese. Nejvyšší exprese by měla být podle očekávání detekována u vzorků z T. medium, který obsahuje mnohem více fytoestrogenů než T. pratense odrůda Tatra. Kandidátními geny, které splňují tuto podmínku, jsou 3 geny z rodiny EC2.3.1.74 (g22367, g49163 a g55136) a 1 gen z rodiny EC2.3.1.170 (g57262). U ostatních analyzovaných genů jsou expresní hladiny na první pohled náhodné a nesouvisí se zjištěným obsahem fytoestrogenů nebo s ploidií rostliny.


nahoru