| | | |


Hana Sedláčková

Úloha helikázy RECQ4 na správné segraci chromozomů během mitózy

RecQ helikázy označovány jako „ochránci genomu“ jsou enzymy, které zastávají nepostradatelné funkce v replikaci a opravě poškozené DNA, a tím zabraňují vzniku neoplastické transformace. V lidských buňkách bylo objeveno 5 RecQ helikáz: RECQ1, BLM, WRN, RECQ4 a RECQ5. V naší laboratoři se zaměřujeme především na RECQ4 protein, protože je nejméně prostudovaným členem. I přesto že byla publikována celá řada prací o RECQ4, stále není známá jeho přesná úloha v metabolismu DNA.

Naše předchozí výsledky ukázaly, že RECQ4 protein vykazuje vysokou afinitu k rozvětveným DNA strukturám (např. Holliday junction, HJs). Nicméně studiem helikázové a ATPázové aktivity RECQ4 bylo zjištěno, že RECQ4 protein nebude schopen rozplétat tyto DNA substráty jako je tomu u jiných helikáz, např. BLM nebo WRN. Proto jsme se rozhodli zjistit, zda se spolu s RECQ4 na rozkladu rozvětvených DNA substrátů podílí i ostatní proteiny, jako je například strukturně specifická endonukleáza MUS81-EME1.

Pomocí in vitro pull-down experimentu byla studována interakce mezi RECQ4 a MUS81-EME1. Bylo zjištěno, že MUS81 interakční doména se nachází v oblasti 322-400 aminokyselin. Dále analýza ukázala, že tato interakci je zprostředkována přes protein MUS81 a RECQ4 interakční doména byla zmapována v oblasti 1-125 aminokyselin proteinu MUS81. Prostřednictvím in vitro nukleázového experimentu bylo pozorováno, že protein RECQ4 dramaticky stimuluje endonukleázovou aktivitu proteinového komplexu MUS81-EME1. Navíc tato stimulace byla 5-krát vyšší v případě preinkubace RECQ4 s DNA, což dokazuje, že RECQ4 patrně rozpoznává rozvětvené DNA struktury a cílí do tohoto místa endonukleázu MUS81-EME1, která je pak rozštěpí. Při detailnějším mapování této domény bylo prokázáno, že aminokyseliny 353-355 proteinu RECQ4 hrají pravděpodobně zásadní roli při interakci a stimulaci proteinového komplexu MUS81-EME1. Jelikož mutant RECQ4 postrádající zmíněné aminokyseliny není schopen interagovat ani stimulovat aktivitu MUS81-EME1 v porovnání s wild-type RECQ4.

Spolu s Univerzitou v Kodani byl publikován v mezinárodním časopise Oncotarget článek zabývající se úlohou RECQ4 a MCM10 při počátku replikace DNA. Kliszczak M, Sedlackova H, Pitchai GP, Streicher WW, Krejci L, Hickson ID. Interaction of RECQ4 and MCM10 is important for efficient DNA replication origin firing in human cells. Oncotarget 2015, 6: 40464-40479


nahoru