| | | |


Pavol Bárdy

Klonování strukturních kapsidových genů bakteriofága 812 a exprese proteinů pro 3D strukturní analýzu

Práca je súčasťou projektu analýzy štruktúry polyvalentného bakteriofága 812 (prebiehajúca v spoluprácii s inštitútom CEITEC), ktorý má potenciál ako alternatívne liečivo stafylokokových infekcií, vrátane tých spôsobených kmeňmi rezistentných k antibiotikám. Štruktúrna analýza pomáha pochopiť základné biologické vlastnosti a umožňuje lepšie popísať bakteriofága pre potreby farmaceutického priemyslu. Aby mohli byť jednotlivé proteíny fága analyzované, je potreba prirpaviť ich v čistej forme a dostatočnom množstve. Pre tento účel bol zvolený postup naklonovania a modifikácie génov kódujúcich jednotlivé štruktúrne proteíny histidínovou kotvou pre možnosť ich expresie a prečistenia afinitnou chromatografiou. Počas riešenia projektu sa dosiahli nižšie uvedené výsledky. Úspešné naklonovanie génových konštruktov predikovanej hydrolázy TmpE, portálového proteínu Prt fága 812 a dvoch variant morfogenického proteínu TmpF (fága 812 a jeho mutanty K1-420) do vektorov rady pET28, umožňujúce spojenie ich C-konca s histidínovou kotvou. Transformovanie všetkých variant rekombinantných vektorov do expresných kultúr E. coli BL21(DE3), vyhľadanie optimálnych expresných podmienok. Overenie expresie MS analýzou pre proteíny TmpE a Prt, purifikácia týchto proteínov pomocou kombinácie metód afinitnej chromatografie na His-trapovej kolóne a gélovej filtrácie. Proteín Prt pri prečistení trpí degradáciou N-konca pravdepodobne bunkovými proteázmi a pre kryštalizačný experiment je nutné toto štiepenie potlačiť pridaním inhibítorov proteáz do sonikačného pufru. Varianta TmpF_K1-420 sa MS analýzou identifikovala v malom množstve a proteín sa afinitnou chromatografiou nepodarilo prečistiť. V čase uzávierky projektu dosiaľ prebieha MS analýza varianty TmpF_812. Zisk prečisteného proteínu TmpE o koncentrácii 22 mg/ml s koncentráciou 5,6 mg/ml ako optimálnou pre kryštalizačný experiment, určenou procesom zrážania proteínu v pufroch. Testovanie 12 sád skríningových doštičiek, každá s 96 kryštalizačnými podmienkami, s výsledkom zisku malých kryštálov, zatiaľ nevhodných pre difrakčný experiment. Funkčná analýza hydrolytickej funkcie proteínu o koncentrácii 22 mg/ml na bunkové steny a viabilitu Staphylococcus aureus, predikovaná enzymatická funkcia nebola zatiaľ potvrdená. Vytvorenie originálnej rešeršnej publikácie mapujúcej doteraz neucelenú problematiku modifikovaných bakteriofágov v aplikovanom mikrobiologickom výskume.


nahoru